Kiekvienos polimerazės grandininės reakcijos (PGR) reakcijos komponentų koregavimas gali pakeisti rezultato kokybę, pagerindamas arba sumažindamas produkto derlingumą ir kokybę, arba pagerindamas reakcijos specifiškumą ir jautrumą. Parametrai, kurie turi įtakos galutiniam rezultatui, gali būti fiziniai (ty temperatūra, ciklo laikas) arba cheminė medžiaga (ty šablono koncentracija, naudojamo fermento rūšis). Toliau pateikiami keli pagrindiniai veiksniai, darantys įtaką PGR sėkmei.
01 švarios laboratorijos sąlygos
Kadangi PCR yra pajėgi aptikti vieną DNR molekulę, svarbu išlaikyti nesugadintas sąlygas laboratorijoje. Visada dėvėkite šviežias pirštines, naudokite sterilius indus, vamzdelius ir pipetės antgalius bei sterilius tirpalus ir prieš pradėdami dirbti išvalykite darbo vietą.
Visada įterpkite kontrolines reakcijas, be šabloninės DNR ir be fermentų, kad būtų užtikrinta, jog rezultatai yra iš tikrųjų dėl gero mėginio sustiprinimo.
Dauguma žmonių turi turėti savo rinkinį sprendimų, kurie nėra bendri, kad būtų lengviau ieškoti trikčių, ir dažniausiai skirtos pipetės yra skirtos tik PCR. DNazės ir RNazės neturinčios PCR vamzdeliai, aerozoliui atsparūs pipetės antgaliai ir dirvos dulkių gaubtas su UV spinduliais taip pat yra būdai, kaip sumažinti problemas.
02 Cheminiai komponentai
- Turi nuo 18 iki 24 bazių
- Nebūna antrinės struktūros (ty kilpų kilpos)
- Turite subalansuotą G / C ir A / T porų pasiskirstymą
- Nepriklausomi vienas nuo kito 3 pėdų galuose
- Ar tirpimo temperatūra (Tm) apie 5-10 laipsnių Celsijaus yra žemesnė už atkaitinimo temperatūrą, kuri paprastai yra tarp 55 ir 65 laipsnių Celsijaus
Abiejų pradmenų Tm taip pat turėtų būti panašūs, kad būtų pasiekti geriausi rezultatai.
03 Reakcijos mišinys: šablonas ir gruntai
Optimali grunto koncentracija yra tarp 0,1 ir 0,6 mikromolio / L. Šablono dydis priklauso nuo DNR tipo (žmogaus, bakterijos, plazmidės).
Naudojant labai mažus šablonus, yra kitų strategijų, kaip pagerinti rezultatus, pvz., Padidinti ciklų skaičių arba naudoti "karštą paleidimą". Visada bandykite naujus gruntus su teigiamąja kontroline reakcija, kad įsitikintumėte, jog jie dirba pagal jūsų konkrečias eksperimentines sąlygas.
04 Reakcijos mišinys: fermentų aktyvumas
MgCl2 koncentracija reakcijos mišinyje gali paveikti PGR rezultatus ir gali atlikti svarbų vaidmenį dar sudėtingesnėse reakcijose. Magnio katijonas formuoja tirpius kompleksus su dNTP, kad gautų faktinį substratą, kurį pripažįsta polimerazės fermentas.
Visų keturių dNTP lygių lygiai taip pat padeda sumažinti polimerazės klaidų lygį. Tam tikri priedai, tokie kaip betainas, BSA, plovikliai, DMSO, glicerolis ir pirofosfatazė, taip pat gali paveikti fermentų specifiškumą ar reakcijos efektyvumą.
05 Termociklininko tipas
Perkant laboratorinę įrangą, nepamirškite, kad kai kurie termocikleriai yra mažiau tikslūs nei kiti, išlaikydami tikslią, pageidaujamą temperatūrą.
Tai yra viena iš sričių, kurioje pigūs važiavimai ilgą laiką nebus atsipirkę, kai susidursite su smulkiu reakcija arba naudosite gruntus, kuriems reikia nedidelio atkaitinimo temperatūros intervalo.
Plonasieniai reakcijos vamzdeliai, pritaikyti tiksliai naudojamam termocikleriui, taip pat padeda optimizuoti reakcijos temperatūras.
06 ciklo nustatymai
Padidėjęs derlius gali būti pasiektas didinant pratęsimo laiką apie kiekvienus 20 ciklų, siekiant kompensuoti mažiau fermentų, kad būtų galima sustiprinti daugiau šablonų. Paprastai, mažiau nei 40 ciklų yra pakankamai, kad sustiprintų mažiau nei 10 šabloninių molekulių iki tokios koncentracijos, kad būtų galima pamatyti etidiumo bromido dažytame agarozės gelyje .