Genų klonavimas - tai vieno geno kopijų arba klonų kūrimas. Nustačius geną, klonai gali būti naudojami daugelyje biomedicinos ir pramonės tyrimų sričių. Genetinė inžinerija - genų klonavimo į naujus organizmus procesas arba DNR seka, pakeičianti baltyminį produktą. Genetinė inžinerija priklauso nuo mūsų gebėjimo atlikti šias esmines procedūras.
01 polimerazės grandinės reakcija
02 apribojimų fermentai
Fermentų, vadinamų restrikcijos endonukleazėmis, atradimas baltymų inžinerijai buvo labai svarbus. Šie fermentai nukenčia DNR konkrečiose vietose, remdamiesi nukleotidų seka. Šimtai skirtingų restrikcijos fermentų , galinčių pjaustyti DNR į atskirą vietą, buvo izoliuoti iš daugybės skirtingų bakterijų štamų. DNR, suskaidytas su restrikcijos fermentu, gamina daugybę mažesnių įvairių dydžių fragmentų. Jie gali būti atskirti naudojant gelio elektroforezę arba chromatografiją.
03 elektroforezė
DNR išvalymas iš ląstelių kultūros arba pjovimas naudojant restrikcinius fermentus nebūtų labai naudingas, jei negalėtume vizualizuoti DNR, ty rasti būdą, kaip pamatyti, ar jūsų ekstraktas yra nieko, ar kokio dydžio jūsų fragmentas Aš ją supjaustau. Vienas iš būdų tai padaryti yra gelio elektroforezė. Geliai yra naudojami įvairiems tikslams, nuo peržiūros išpjaustytos DNR iki DNR įterpiklių ir išpuolių aptikimo.
04 prisijungti prie dviejų DNR dalių
Genetiniuose tyrimuose dažnai būtina susieti du ar daugiau atskirų DNR grandžių, sukurti rekombinantinę giją arba uždaryti apskritimo grandinę, kuri buvo supjaustyta su restrikcijos fermentais. Fermentai, vadinami DNR ligazais, gali sukurti kovalentines ryšius tarp nukleotidų grandinių. Šiame procese taip pat svarbūs fermentai DNR polimerazė I ir polinukleotidinė kinazė, atitinkamai užpildyti spragas arba fosforilinti 5 'galus.
05 mažos savireguliavimo DNR pasirinkimas
Mažos apskritos DNR dalys, kurios nėra bakterinio genomo dalis, bet gali savaime replikuotis, yra žinomos kaip plazmidės. Plazmidai dažnai naudojami kaip vektoriai, skirti genų transportavimui tarp mikroorganizmų. Biotechnologijose, kai dominuojantis genas buvo sustiprintas, o genai ir plazmidės buvo supjaustyti restrikcijos fermentais, jie lignuojami kartu, taip sukuriant tai, kas vadinama rekombinantine DNR. Virusinė (bakteriofagos) DNR taip pat gali būti naudojama kaip vektorius, kaip ir kosmidai, rekombinantinės plazmidės, kurių sudėtyje yra bakteriofagų genų.
06 metodas vektoriui perkelti į priimančiosios ląstelės
Genetinės medžiagos perkėlimas į vektorių, pvz., Plazmidę, į naujas šeimininko ląsteles vadinamas transformacija. Šis metodas reikalauja, kad ląstelės šeimininkės būtų veikiamos aplinkos pokyčių, dėl kurių jie "kompetentingi" arba laikinai pralaidūs vektoriui. Viena iš tokių metodų yra elektroporacija. Kuo plazmidė didesnė, tuo mažesnė efektyvumas, su kuriuo susiduria ląstelės. Didesni DNR segmentai yra lengviau klonuojami naudojant bakteriofagus, retrovirusus ar kitus virusinius vektorius arba kosmidus metodu, vadinamu transdukcija. Phage ar virusiniai vektoriai dažnai naudojami regeneracinėje medicinoje, tačiau gali sukelti DNR įterpimą į dalis mūsų chromosomų, kuriose mes to nenorime, sukeliančių komplikacijas ir netgi vėžį.
07 Transgeninių organizmų parinkimo metodai
Ne visos ląstelės perneša DNR per transformaciją. Labai svarbu, kad būtų nustatytas būdas, kaip tai padaryti. Apskritai, plazmidėse yra genų, skirtų atsparumui antibiotikams, ir transgenines ląsteles galima parinkti remiantis šių genų ekspresija ir jų gebėjimu augti žiniasklaidoje, kuriame yra šis antibiotikas. Alternatyvūs atrankos metodai priklauso nuo kitų reporterių baltymų, tokių kaip x-gal / lacZ sistema, arba žalias fluorescencijos baltymas, kurie leidžia pasirinkti priklausomai nuo spalvos ir fluorescencijos.