Būtinas baltymų grynumo laipsnis priklauso nuo numatyto galutinio baltymo naudojimo.
Kai kurioms reikmėms pakanka žalio ekstrakto. Tačiau kitiems tikslams, pavyzdžiui, maisto produktams ir farmaciniams preparatams, reikalingas aukštas grynumo lygis. Tam, kad būtų pasiektas šis procesas, dažniausiai naudojami baltymų valymo metodai, kurie yra atliekami gryninimo etape.
Kiekvienas baltymų valymo etapas paprastai sukelia tam tikrą produkto praradimą. Todėl ideali baltymų valymo strategija yra ta, kurioje aukščiausia gryninimo lygis pasiekiamas kuo greičiau. Parinkimas, kokius žingsnius naudoti, priklauso nuo tikslinio baltymo dydžio, krūvio, tirpumo ir kitų savybių. Šie metodai labiausiai tinka vienam citozoliniam baltymui išvalyti. Citozolinių baltymų kompleksų valymas yra sudėtingesnis, todėl dažniausiai reikia taikyti skirtingus metodus.
Pirmieji baltymų valymo veiksmai
Pirmasis žingsnis valant intracellular (viduje ląstelių) baltymų yra ruošiant žaliavinį ekstraktą .
Ekstraktas bus sudėtinis visų baltymų mišinys iš ląstelių citoplazmos ir kai kurių papildomų makromolekulių, kofaktorių ir maistinių medžiagų. Neapdorotas ekstraktas gali būti naudojamas tam tikroms biotechnologijų taikymui, tačiau jei grynumas yra problema, turi būti laikomasi tolesnių valymo veiksmų.
Nevalyti baltyminiai ekstraktai yra paruošiami pašalinus ląstelių liekanas, susidariusius ląstelių lizės būdu, kuris gaunamas naudojant chemines medžiagas ir fermentus , ultragarsu arba "French Press". Šiukšlės pašalinamos centrifuguojant ir supernatantas išgaunamas. Netetinius ekstruzijų ląstelių baltymų preparatus galima gauti paprasčiausiai pašalinant ląsteles centrifuguojant.
Tam tikroms biotechnologinėms reikmėms yra termostatuojamų fermentų poreikis: fermentai, kurie gali toleruoti aukštą temperatūrą be denatūravimo ir išlaikant didelę specifinę veiklą. Jas gaminantys organizmai kartais vadinami ekstremofiliumi. Lengvas požiūris į šilumą atsparių baltymų valymą yra denatūravimas kitiems mišinio baltymams šildant, po to aušinant tirpalą (tokiu būdu leisti termostabilumui fermentą, jei reikia, jį iš naujo ištirpinti arba iš naujo ištirpinti. Denatūruotus baltymus galima pašalinti centrifuguojant.
Tarpiniai valymo etapai
Anksčiau bendras antrojo žingsnio baltymų iš žalio ekstrakto valymui buvo nusodinimas tirpale, turinčiame didelę osmosinę koncentraciją (ty druskų tirpalus). Nepilnojo ekstrakto nukleino rūgštys gali būti pašalinamos nusodinant agregatus, susidarančius su streptomicino sulfatu arba protamino sulfatu.
Baltymų nusodinimas paprastai atliekamas naudojant amonio sulfatą kaip druską.
Skirtingi baltymai išsiskiria skirtingomis amonio sulfato koncentracijomis. Apskritai aukštesnės molekulinės masės baltymai nusodina mažesnes amonio sulfato koncentracijas. Druskos rūgštingumas paprastai nėra labai išgrynintas baltymas, bet gali padėti pašalinti kai kuriuos nepageidaujamus baltymus mišinyje ir koncentruoti mėginį. Tirpalo druskos pašalinamos dializuojant per akytas celiuliozės vamzdelius, filtravimą arba gelio išskyrimo chromatografiją.
Šiuolaikiniai biotechnologijų protokolai dažnai naudojasi daugybe komerciškai prieinamų rinkinių, kurie pateikia gatavus standartinių procedūrų sprendimus. Baltymų gryninimas dažnai atliekamas naudojant filtrus ir paruoštas gelio filtravimo koloneles. Viskas, ką jums reikia padaryti, laikykitės instrukcijų ir pridėkite tinkamą tinkamo tirpalo tūrį ir palaukite nurodytą laiko tarpą, kol surenkate eluantą (kuris išplaukia iš kitos kolonėlės galo) šviežio bandymo mėgintuvėlyje.
- Chromatografiniai metodai gali būti taikomi naudojant stalviršinius stulpelius arba automatizuotą HPLC įrangą. HPLC atskyrimas gali būti atliekamas naudojant atvirkštinę fazę, jonų mainų arba dydžio išskyrimo metodus ir mėginius, aptiktus diodine ar lazerine technika. The
Baltymų vizualizavimas ir gryninimo įvertinimas
- Grįžtamojo fazės chromatografija (RPC) atskiria baltymus, atsižvelgiant į jų santykinį hidrofobiškumą . Ši technika yra labai selektyvi, tačiau reikalinga naudoti organinius tirpiklius. Kai kurie baltymai yra nuolat denatūruojami tirpikliais ir praranda funkcionalumą RPC metu. Todėl šis metodas nerekomenduojamas visoms naudojimo reikmėms, ypač jei tai reikalinga, kad tikslinis baltymas išlaikytų aktyvumą.
- Jonų mainų chromatografija reiškia baltymų atskyrimą, pagrįstą įkrova . Stulpeliai gali būti paruošti anijonų mainams ar katijonams. Anijonų mainų kolonėlėse yra nejudančioji fazė su teigiamu krūviu, kuris pritraukia neigiamai įkrautus baltymus. Katijonų mainų kolonos yra atvirkštinės, neigiamai užpildytos granulės, kurios pritraukia teigiamai įkrautus baltymus. Tikslinio baltymo (-ų) eliuavimas atliekamas keičiant pH kolonėlėje, dėl kurio kiekvieno baltymo funkcinės grupės pakeičiamos arba neutralizuojamos.
- Dydžio išskyrimo chromatografija ( gelio filtracija ) atskiria didesnius baltymus nuo mažų, nes didesnės molekulės gretimoje chromatografijos kolonoje kryžminiu polimeru. Dideli baltymai netelpa į polimero poras, tuo tarpu mažesni baltymai daro ir ilgiau važiuoja per chromatografijos koloną per mažiau tiesioginį kelią. Eluatas yra surenkamas iš serijos vamzdelių, atskiriančių baltymus, remiantis eliuavimo trukme. Gelių filtravimas yra naudinga baltymų mėginio koncentravimo priemonė, nes tikslinis baltymas surenkamas mažesniu eliuavimo tūriu, nei iš pradžių buvo dedama į kolonėlę. Panašūs filtravimo metodai gali būti naudojami didelio masto baltymų gamyboje dėl jų ekonomiškumo.
- Afininė chromatografija yra labai naudinga "poliravimo" ar baltymo valymo proceso užbaigimo technika. Kreidos chromatografijos kolonoje yra susietos su ligandais, kurie yra specifiškai susieti su tiksliniu baltymu. Baltymas pašalinamas iš kolonėlės skalavimo tirpalu, kuriame yra laisvų ligandų. Šis metodas suteikia gryniausius rezultatus ir aukščiausią specifinę veiklą palyginus su kitais metodais.
- SDS-PAGE yra poliakrilamido gelio elektroforezė, atliekama esant SDS (natrio dodecyl sulfato), kuris jungiasi prie baltymų, todėl jiems yra didelis neto neigiamas krūvis. Kadangi visų baltymų sąnaudos yra gana vienodos, šis metodas jas beveik visiškai atskiria pagal dydį. SDS-PAGE dažnai naudojamas baltumo grynumui tikrinti po kiekvieno serijos etapo. Kadangi nepageidaujami baltymai palaipsniui pašalinami iš mišinio, SDS-PAGE gelyje vizualizuojamų juostų skaičius sumažėja, kol yra tik viena juosta, reprezentuojanti pageidaujamą baltymą.
- Immunoblotingas yra baltymų vizualizavimo metodas, taikomas kartu su afinine chromatografija. Konkretaus baltymo antikūnai yra naudojami kaip afininės chromatografijos kolonėlės ligandai. Tikslinis baltymas paliekamas kolonėlėje, po to pašalinamas kolonėlės skalavimas druskos tirpalu ar kitais preparatais. Antikūnai, susiję su radioaktyviosiomis arba dažų etiketėmis, padeda nustatyti tikslinį baltymą, kai jis yra atskirtas nuo likusio mišinio.
Šaltiniai:
Zubay G. 1988. Biochemija, 2-asis leidimas. "Macmillan Publishing Co", Niujorkas, NY, JAV.
"Amersham Pharmacia Biotech". 1999. Baltymų valymo vadovas, leidimas AB. "Amersham Pharmacia Biotech Inc.", Naujasis Džersis, JAV. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.