Koks PCR turi būti susijęs su genų sekos nustatymu ir stiprinimu
Polimerazės grandininė reakcija ( PGR ) yra molekulinė genetinė technika, skirta daugybės genų kopijoms gaminti ir taip pat yra genų sekos nustatymo proceso dalis.
Kaip veikia polimerazės grandinės reakcija?
Ženminės kopijos daromos naudojant DNR pavyzdį, o technologija yra pakankamai gera, kad būtų galima kopijuoti kelias kopijas iš vienos vienos mėginio aptinkamo geno kopijos. Geno plyšimo amplifikacija, leidžianti pagaminti milijonus kopijų, leidžia nustatyti ir identifikuoti genų sekas, naudojant regėjimo metodus, pagrįstus DNR gabalo dydžiu ir krūviu (+ arba -).
Kontroliuojamomis sąlygomis nedideli DNR segmentai generuojami fermentais, žinomais kaip DNR polimerazės, kurios papildo dezoksinukleotidus (dNTPs) į DNR fragmentą, vadinamą "šablonu". Netgi mažesni DNR gabalai, vadinami "pradmenimis", naudojami kaip polimerazės pradinis taškas. Gruntai yra mažos dirbtinės DNR dalys (oligomerai), paprastai tarp 15 ir 30 nukleotidų. Jie yra pagaminti žinant ar spėlioti trumpas DNR sekas pačioje amplifikuojamo geno galuose. PCR metu nuosekliai apdorota DNR kaitinama ir dvigubos sruogos atskirtos. Po aušinimo pradmenis jungiasi prie šablono (vadinamas atkaitinimu) ir sukuria vietą polimerazei prasidėti.
PGR metodika
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) tapo įmanoma, atradus termofilus ir termofilinius polimerazės fermentus (fermentus, kurie palaiko struktūrinį vientisumą ir funkcionalumą po kaitinimo aukštoje temperatūroje).
PGR metodikos etapai yra šie:
- Sukurtas mišinys, optimizuotas DNR šablono, polimerazės fermento, pradmenų ir dNTP koncentracijos. Gebėjimas šildyti mišinį denatuojant fermentą leidžia denatūruoti DNR mėginio dvigubą spiralę, esant temperatūrai, esant 94 laipsnių Celsijaus laipsniui.
- Po denatūravimo mėginys atšaldomas iki saikingesnio diapazono, apie 54 laipsnius, todėl pradmenų atkaitinimas (įrišimas) palengvina vieno grandies DNR šablonus.
- Trečiuoju ciklo etapu mėginys pakartotinai pašildomas iki 72 laipsnių, idealus Taq DNR polimerazės temperatūra, siekiant pailgėti. Tęsiant pailgėjimą, DNR polimerazė naudoja pradinę vienos DNR sritį kaip šabloną, kad į kiekvieno grunto 3 'galus papildytų papildomus dNTP, ir generuotų dvigubos DNR sekcijos dominančio geno srityje.
- Gruntai, kurie atkaitinti į DNR seką, kuri nėra tiksli atitiktis, neatsiranda atkaitinant 72 laipsnių kampu, todėl ribojamas pailgėjimas su dominuojančiu genu.
Šis denatūravimo, atkaitinimo ir pailgėjimo procesas kartojamas kelis kartus (30-40) kartus, todėl eksponentiškai didėja pageidaujamo geno kopijų skaičius mišinyje. Nors šis procesas būtų gana nuobodus, jei atliekamas rankiniu būdu, mėginiai gali būti ruošiami ir inkubuojami programuojamuoju termocikliu, kuris dabar dažniausiai būna daugelyje molekulių laboratorijų, o visa reakcija PCR gali būti atliekama per 3-4 valandas.
Kiekvienas denatūravimo žingsnis sustabdo ankstesnio ciklo pailgėjimo procesą, tokiu būdu nuimant naująją DNR grandinę ir išlaikant ją maždaug iki pageidaujamo geno dydžio.
Pailgėjimo ciklo trukmė gali būti ilgesnė ar trumpesnė priklausomai nuo dominančio geno dydžio, bet galiausiai, pasikartojant PCR ciklams, dauguma šablonų bus apriboti tik dominuojančio geno dydžiu, nes jie bus pagamintas iš abiejų pradmenų produktų.
Sėkmingai atliktai PGR procedūrai būdingi keli skirtingi veiksniai , kuriuos galima manipuliuoti siekiant pagerinti rezultatus. Labiausiai paplitęs PGR produkto tyrimo metodas yra agarozės gelio elektroforezė . Kuris naudojamas atskirti DNR fragmentus pagal dydį ir įkrovą. Tada fragmentai vizualizuojami naudojant dažiklius arba radioizotopus.
Evoliucija
Nuo PCR atradimo atsirado kitų DNR polimerazių, nei pradinis Taq. Kai kurie iš jų turi geresnį "korektūros" gebėjimus arba yra stabilesni aukštesnėje temperatūroje, taigi pagerina PGR specifiškumą ir mažina klaidas įvedus netinkamą dNTP.
Kai kurie PGR variantai buvo sukurti tam tikroms reikmėms ir dabar juos reguliariai naudojami molekulinės genetinėse laboratorijose. Kai kurie iš jų yra realaus laiko PGR ir atvirkštinės transkriptazės PCR. PGR tyrimas taip pat paskatino DNR sekos nustatymą, DNR pirštų atspaudus ir kitus molekulinius metodus.