Kaip šie endonuceleases išsiskiria
Kiek žinai apie restrikcijos fermentus? Su šia peržiūra supraskite, ką jie daro ir kodėl jie yra svarbūs.
Apribojimų fermentų apibrėžimas
Apribojimų endonukleazės yra fermento klasė, kuri nukirsta DNR molekules. Kiekvienas fermentas atpažįsta unikalią nukleotidų seką DNR grandinėje. Tokios sekos paprastai yra maždaug nuo 4 iki 6 bazinių porų ilgio. Sekos yra palindrominės, nes komplementariosios DNR grandinės ta pati seka yra tik atvirkštine kryptimi.
Kitaip tariant, abi DNR sruogos nukirsta toje pačioje vietoje.
Kur randami šie fermentai
Apribojimų fermentai randami daugelyje skirtingų bakterijų štamų, kur jų biologinis vaidmuo yra dalyvauti ląstelių gynyboje. Šie fermentai "apriboja" svetimą (pvz., Virusinę) DNR, kuri patenka į ląstelę, ją sunaikindama. Ląstelė-šeimininkė turi apribojimo-modifikavimo sistemą, kuri metilina savo DNR atitinkamiems restrikcijos fermentams būdingose vietose, tokiu būdu apsauganti ją nuo skilimo. Surasta daugiau kaip 800 žinomų fermentų, kurie atpažįsta daugiau nei 100 skirtingų nukleotidų sekų.
Naudoti biotechnologijoje
Apribojimų fermentai naudojami biotechnologijoje, siekiant sumažinti DNR į mažesnes dalis, siekiant ištirti individų fragmentų ilgio skirtumus (apribojimo fragmento ilgio polimorfizmas - RFLP). Jie taip pat naudojami genų klonavimui.
RFLP metodika buvo naudojama nustatyti, ar individai ar asmenų grupės turi skirtingų genų sekų ir ribojimo skilimo modelių tam tikrose genomo srityse.
Žinios apie šias unikalias sritis yra DNR pirštų atspaudų pagrindas . Kiekvienas iš šių metodų priklauso nuo agarozės gelio elektroforezės panaudojimo DNR fragmentų atskyrimui. TBE buferis, sudarytas iš Tris bazės, boro rūgšties ir EDTA, dažnai naudojamas agarozės gelio elektroforezei tirti DNR produktus.
Apribojimų fermentų tipai
Yra trys skirtingi restrikcijos fermentų tipai. I rūšis nukenčia DNR atsitiktinėse vietose iki 1000 ar daugiau bazinių porų iš pripažinimo vietos. III tipo gabalai yra maždaug 25 bazinės poros nuo aikštelės. I ir III tipai reikalauja ATP ir gali būti dideli fermentai su keliais daliniais vienetais. II tipo fermentai, kurie daugiausia naudojami biotechnologijoje, išpjauti DNR pripažintoje seka, nereikalaujant ATP, yra mažesni ir paprastesni.
II tipo restrikcijos fermentai yra pavadinti pagal bakterijų rūšis, iš kurios jie yra izoliuoti. Pvz., Fermentas EcoRI buvo izoliuotas iš E. coli . Dauguma gyventojų yra susipažinę su E. coli protrūkiais maiste.
II tipo restrikcijos fermentai gali sukelti dviejų skirtingų tipų pjūvius, priklausomai nuo to, ar jie pjauna abi kryptis atpažinimo sekos viduryje arba kiekviena juosta yra arčiau vieno pripažinimo sekos galo.
Buvęs pjūvis sukurs "nelygius galus" be nukleotidų pakilimų. Pastaroji sukuria "lipni" arba "darnius" galus, nes kiekvienas iš gautų DNR fragmentas turi iškyšą, kuris pagirtino kitus fragmentus. Abi yra naudingos molekulinės genetikos, skirtos rekombinantinei DNR ir baltymams gaminti.
Ši DNR forma išsiskiria, nes ji susidaro iš dviejų ar daugiau skirtingų grandžių, kurie iš pradžių nebuvo sujungti, susimaišyti (sujungti kartu).