DNR sekos nustatymas taip pat priklauso nuo mūsų sugebėjimo panaudoti gelio elektroforezę atskiriant DNR grandines, kurių dydis skiriasi tiek pat, kiek viena bazinė pora.
DNR sekvenavimas
1970-ųjų pabaigoje buvo išrastos dvi DNR sekos nustatymo technologijos ilgesnėms DNR molekulėms. Tai buvo metodas Sanger (arba dedexy) ir metodas Maxam-Gilbert (cheminis skilimas). Maksimalaus-Gilberto metodas yra pagrįstas specifinėmis nukleotidų skilimo priemonėmis cheminėmis medžiagomis ir geriausiai naudojamas sekti oligonukleotidus (trumpi nukleotidų polimerai, paprastai mažesni nei 50 bazinių porų ilgio). Sangerio metodas yra dažniausiai naudojamas, nes techniškai lengviau jį taikyti, ir, atsiradus PCR ir automatizuojant metodą, galima lengvai taikyti ilgas DNR grandines, įskaitant kai kuriuos genus. Šis metodas pagrįstas grandinės nutraukimu dideoksinukleotidais PGR pailgėjimo reakcijų metu.
Sanger metodas
Pagal Sanger metodą DNR grandinė, kurią reikia analizuoti, naudojama kaip šabloną, o PCR reakcijoje naudojama DNR polimerazė, skirta generuoti papildomas dalis, naudojant pradmenis.
Paruošiami keturi skirtingi PGR reakcijos mišiniai, kurių kiekvienas turi tam tikrą procentą dideksinukleozido trifosfato (ddNTP) analogų vienam iš keturių nukleotidų (ATP, CTP, GTP arba TTP). Naujos DNR grandinės sintezė tęsiasi tol, kol įjungiamas vienas iš šių analogų, o tuo metu grandis priešlaikinai sutrumpinamas.
Kiekviena PCR reakcija galų gale turės įvairių DNR grandžių ilgio mišinį, kuris baigsis nukleotidu, kuris buvo atitinkamai reakcijai pažymėtas dideksoksi. Gelio elektroforezė yra naudojama keturių reakcijų grandims atskirti keturiose atskirose juostose ir nustatyti pradinio šablono seką, atsižvelgiant į tai, kokie ilgio gysliai baigiasi tuo, kas nukleotidas.
Automatinėje Sanger reakcijoje naudojami gruntai, kurių etiketėje yra keturios skirtingos spalvos fluorescentinės etiketės. PGR reakcijos, dalyvaujant skirtingiems didezoksikenotidams, atliekamos, kaip aprašyta aukščiau. Tačiau po to keturi reakcijos mišiniai yra sumaišomi ir padedami į vieną gelio juostą. Kiekvieno fragmento spalva aptikta naudojant lazerio spindulį, o informaciją renka kompiuteris, generuojantis chromatogramas, kuriose rodomos kiekvienos spalvos smailės, iš kurių galima nustatyti šablono DNR seką.
Paprastai automatinis sekos nustatymo metodas yra tik tikslus sekas, kurių ilgis yra ne mažesnis kaip 700-800 bazinių porų. Vis dėlto galima gauti išsamių didelių genų sekų ir iš tiesų viso genomų, naudojant žingsnius metodus, tokius kaip Primer Walking ir Shotgun sekvenavimas.
" Primer Walking" , veikianti didesnio geno dalis nuosekliai naudojama Sanger metodu. Nauji gruntai generuojami iš patikimos seka serijos ir naudojami tam, kad būtų toliau sekama genas, kurio pradinės reakcijos buvo mažesnės.
Šaunamojo ginklo sekvenavimas reiškia, kad atsitiktinai pjaustomas DNR segmentas yra labiau tinkamas (valdomas) dydžio fragmentas, kiekvieno fragmento sekvenavimas ir gabalėlių sutvarkymas remiantis sutampančiomis sekomis. Šią techniką lengviau pritaikius kompiuterių programinei įrangai, skirtai sutampantiems elementams sutvarkyti.